終止液的加入順序和速度會影響ELISA試劑盒的吸光度讀數嗎？?
日期：2026-01-13 11:05:30
終止液的加入順序和速度，都會顯著影響ELISA的吸光度（OD 值）讀數，且這種影響在不同反應條件下會有差異。
一、 加入順序的影響
ELISA 中終止液（通常是 2 M H?SO?，用于終止辣根過氧化物酶 HRP 催化的 TMB 顯色反應）的加入順序，核心是要保證每一個反應孔在相同顯色時長后被同步終止。
順序混亂 / 不同步：若不是從第一孔到最后一孔按固定順序快速加入，而是跳孔、往返加樣，會導致不同孔的實際顯色時間出現偏差。顯色反應是隨時間逐步加深的，哪怕只有幾秒的差異，也會讓后終止的孔 OD 值偏高，尤其在顯色后期（反應接近平臺期前），這種偏差會被放大。
對照孔與樣品孔不同步：若先終止樣品孔、后終止空白 / 陰性 / 陽性對照孔，會導致對照孔顯色時間更長，OD 值異常升高，破壞對照體系的準確性，進而影響樣品濃度的判讀。
建議順序：必須按固定方向（如從左到右、從上到下） 逐孔連續加入，且起始和結束的時間點要記錄，確保所有孔的顯色時長完全一致。
二、 加入速度的影響
加入速度的核心問題是局部酸濃度過高導致的顯色產物沉淀 / 分解，以及加樣時間差帶來的顯色不均。
過快加入：
終止液若呈液柱直接沖擊孔底的顯色液，會造成局部瞬時強酸環境。TMB 的顯色產物在強酸性條件下易出現微小沉淀，或局部顏色猝滅，導致孔內顏色分布不均，吸光度讀數偏低且重復性差；
若加樣針未及時沖洗或滴液，過快加樣還可能導致孔間交叉污染，進一步干擾結果。
過慢加入：
逐孔加樣速度過慢，會使前后孔的顯色時間差被拉長（比如加完一整板用時超過 30 秒）。對于動力學反應較快的顯色體系，這種時間差會導致 OD 值梯度偏差，尤其在低濃度樣品孔中，讀數誤差會顯著影響檢出限和定量準確性；
過慢加樣還可能讓空氣中的雜質落入反應孔，或導致孔內液體蒸發，間接影響吸光度。
建議速度：加樣時應緩慢、勻速、沿孔壁加入，避免直接沖擊液面；整板加樣時間建議控制在 10–20 秒內，同時保持加樣針的沖洗頻率，防止交叉污染。
三、 補充影響因素與控制要點
終止液溫度：室溫終止液比低溫終止液反應更穩定，溫度波動會間接影響終止速度和顯色產物穩定性，進而影響 OD 值；
混勻操作：終止后輕輕拍板混勻即可，劇烈震蕩會導致顯色產物沉淀，影響讀數；
讀數時間：終止后應在試劑盒規定時間內（通常 15 分鐘內）完成讀數，延遲讀數會因顯色產物氧化褪色導致 OD 值下降。
