穩(wěn)轉細胞株構建服務流程

日期：2026-01-27 15:26:44

穩(wěn)轉細胞株構建是將外源目的基因整合到細胞基因組中，實現(xiàn)目的基因長期、穩(wěn)定表達（或敲低/敲除）的核心實驗技術，服務端的標準化流程會圍繞客戶需求確認→載體構建→細胞轉染→陽性克隆篩選→鑒定交付五大核心環(huán)節(jié)展開，同時包含全程質控和售后技術支持，適配過表達、RNAi敲低、CRISPR/Cas9敲除/敲入等不同構建需求，以下是通用且標準化的商業(yè)服務流程，兼顧實驗嚴謹性和服務落地性：

一、穩(wěn)轉細胞株構建服務標準化流程

1、前期溝通與需求確認（1-3個工作日）

這是服務的基礎，核心是明確構建目標、細胞類型、篩選要求，避免實驗偏差，服務方與客戶對接確認以下關鍵信息：

構建類型：目的基因過表達（含野生型/突變型）、shRNA慢病毒敲低、CRISPR/Cas9基因敲除/定點敲入、報告基因融合表達（如GFP/RFP/Flag）、組蛋白修飾相關穩(wěn)轉（如修飾酶過表達/敲除）等；

細胞信息：客戶提供細胞株（需明確細胞名稱、種屬、培養(yǎng)條件、是否貼壁/懸浮、細胞狀態(tài)要求），或服務方提供常規(guī)商用細胞（如293T、Hela、HepG2、MCF-7等）；

篩選標記：確定抗性篩選標簽（嘌呤霉素Puromycin、潮霉素Hygromycin、新霉素G418、博來霉素Zeocin），或熒光標記（GFP/RFP），優(yōu)先選擇與細胞本身無交叉的標記；

表達要求：組成型表達（CMV/EF1α/Ubc啟動子）、誘導型表達（Tet-On/Tet-Off系統(tǒng)）、組織/細胞特異性啟動子驅動表達；

交付標準：單克隆穩(wěn)轉株/多克隆穩(wěn)轉株、篩選濃度摸索結果、表達鑒定數(shù)據(jù)、細胞培養(yǎng)手冊等；

其他需求：如無血清適應、穩(wěn)轉株傳代穩(wěn)定性驗證（一般傳代10代以上）、凍存管數(shù)量等。

交付物：《穩(wěn)轉細胞株構建服務確認單》，明確所有實驗參數(shù)和交付標準，雙方確認后啟動實驗。

二、載體構建與驗證（3-7個工作日，依構建難度調整）

根據(jù)客戶需求構建重組表達載體/敲低/敲除載體，并完成體外驗證，確保載體有效性，是穩(wěn)轉構建的關鍵前提，分兩種情況：

情況1：客戶提供目的基因質粒/片段

對客戶提供的質粒進行抽提和鑒定（酶切/PCR/測序），驗證基因序列正確性；

將目的基因亞克隆至服務方的穩(wěn)轉專用載體（含篩選標記、啟動子），構建重組載體；

重組載體的陽性克隆鑒定：挑取單菌落抽提質粒，進行酶切驗證和Sanger測序，確保基因插入方向、序列無突變。

情況2：服務方全程構建載體

基因合成/調取：根據(jù)客戶提供的GeneID/核苷酸序列，進行目的基因全合成（含密碼子優(yōu)化，提高真核細胞表達效率），或從cDNA文庫中調取基因；

載體構建：將優(yōu)化后的目的基因插入穩(wěn)轉載體，或設計shRNA序列（3-5條有效序列，針對敲低需求）、CRISPRgRNA序列（2-3條高特異性序列，針對敲除/敲入需求），構建對應載體；

載體有效性預驗證：過表達載體轉染293T細胞做瞬時表達驗證（WB/PCR/熒光檢測），shRNA/gRNA載體做敲低/敲除效率預實驗，篩選出高效序列用于后續(xù)穩(wěn)轉。

交付物：重組陽性質粒（凍存管+質粒抽提液）、載體酶切驗證圖、測序報告、瞬時表達/敲低效率驗證數(shù)據(jù)（按需提供）。

三、慢病毒包裝/質粒線性化（2-5個工作日，依轉染方式選擇）

穩(wěn)轉細胞株構建主要采用慢病毒介導法（最常用，整合效率高、適配絕大多數(shù)細胞，包括難轉染細胞），部分易轉染細胞可采用質粒線性化轉染法（直接將線性化質粒轉染細胞，依靠細胞自身同源重組整合），主流服務均以慢病毒法為主，流程如下：

慢病毒包裝：將重組載體+包裝質粒（psPAX2+VSV-G，第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，生物安全性高）共轉染293T細胞，培養(yǎng)48-72h；

病毒液收集與濃縮：收集細胞上清液，通過超速離心/超濾濃縮獲得高滴度慢病毒液；

病毒滴度測定：采用熒光法/抗性篩選法測定病毒滴度（TU/mL），確保滴度≥1×10?TU/mL（保證轉染效率）；

病毒液質控：檢測病毒液無菌性、支原體陰性，避免細胞污染。

交付物：高滴度慢病毒液（凍存管，含保存液）、病毒滴度檢測報告、無菌/支原體檢測報告。

四、細胞轉染與抗性篩選（7-14個工作日，依細胞類型調整）

核心是將慢病毒/線性化質粒導入目標細胞，通過抗性篩選/熒光分選獲得陽性細胞，分為多克隆篩選和單克隆篩選，單克隆株需額外的克隆挑取步驟，時間稍長。

1.預實驗：篩選藥物濃度摸索

對目標細胞進行抗性藥物致死濃度摸索（設置0、0.5、1、2、5、10μg/mL等梯度），培養(yǎng)72-96h后，確定最低致死濃度（MTC）（即能殺死100%未轉染細胞的最低藥物濃度），后續(xù)篩選采用該濃度的80%-100%，既保證殺死陰性細胞，又減少藥物對陽性細胞的毒性。

2.正式轉染/感染

慢病毒感染：將目標細胞鋪板（貼壁細胞鋪6孔板，密度30%-50%），加入慢病毒液+感染增強劑Polybrene（8-10μg/mL，提高感染效率），設置空白對照（未感染細胞）、陰性對照（空病毒感染細胞）；

孵育：37℃、5%CO?培養(yǎng)24-48h，更換新鮮培養(yǎng)基，去除病毒液。

3.陽性細胞篩選

轉染/感染后24-48h，加入預設濃度的抗性藥物進行持續(xù)篩選，每2-3天更換一次含藥培養(yǎng)基，及時清除死細胞；

篩選7-10天后，空白對照/陰性對照細胞全部死亡，實驗組存活的細胞即為抗性陽性細胞（多克隆穩(wěn)轉株）；

若客戶需要單克隆穩(wěn)轉株，則對陽性細胞進行有限稀釋法/克隆環(huán)法/流式分選法挑取單克隆，將單個細胞接種至96孔板，培養(yǎng)至單克隆集落形成后，轉移至24孔板→6孔板→培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)，同時保留每株單克隆的編號。

關鍵質控：全程無菌操作，定期檢測細胞支原體，避免篩選過程中細胞污染；觀察細胞形態(tài)，確保陽性細胞無明顯凋亡、形態(tài)異常。

五、穩(wěn)轉細胞株鑒定與穩(wěn)定性驗證（5-7個工作日）

對篩選得到的多克隆/單克隆穩(wěn)轉株進行分子水平+蛋白水平雙重鑒定，驗證目的基因的穩(wěn)定表達/敲低/敲除效率，并完成傳代穩(wěn)定性驗證，確保株系的有效性和穩(wěn)定性，鑒定方法依構建類型而定：

1.過表達穩(wěn)轉株鑒定

分子水平：提取細胞總RNA，通過RT-qPCR檢測目的基因的mRNA表達水平（與空白/陰性對照比較，計算表達倍數(shù)）；

蛋白水平：提取細胞總蛋白，通過WB（蛋白免疫印跡）檢測目的基因的蛋白表達量，若帶熒光/標簽，可通過熒光顯微鏡/流式細胞術直接檢測；

整合驗證（按需）：通過PCR檢測目的基因是否整合到細胞基因組中（提取細胞基因組DNA，設計特異性引物擴增）。

2.shRNA敲低穩(wěn)轉株鑒定

RT-qPCR+WB檢測目的基因的mRNA和蛋白敲低效率，篩選出敲低效率≥70%（優(yōu)質株系）的穩(wěn)轉株。

3.CRISPR/Cas9敲除/敲入穩(wěn)轉株鑒定

敲除株：通過PCR+測序驗證基因敲除效率（移碼突變/片段缺失），WB驗證蛋白表達缺失；若為點突變敲除，需通過測序確認突變位點；

敲入株：通過PCR擴增敲入?yún)^(qū)域，測序驗證敲入序列的正確性，熒光/標簽檢測敲入基因的表達。

4.傳代穩(wěn)定性驗證

將陽性穩(wěn)轉株連續(xù)傳代10代以上，每3代檢測一次目的基因表達/敲除效率，確保表達水平無明顯下降，符合穩(wěn)轉株的核心要求。

交付物：所有鑒定原始數(shù)據(jù)（RT-qPCR熔解曲線/電泳圖、WB條帶圖、測序報告、熒光照片）、穩(wěn)定性驗證數(shù)據(jù)、陽性株篩選結果表。

六、細胞擴增、凍存與最終交付（3-5個工作日）

對鑒定合格的穩(wěn)轉細胞株進行擴大培養(yǎng)、凍存，并整理全套實驗資料，按服務確認單的標準完成最終交付，流程如下：

細胞擴增：將合格的單克隆/多克隆穩(wěn)轉株擴大培養(yǎng)至足量，確保細胞狀態(tài)良好（活率≥95%）；

細胞凍存：采用標準凍存液（培養(yǎng)基+10%FBS+10%DMSO），凍存至液氮中，一般交付3-5支凍存管（每管≥1×10?個細胞），按需可增加凍存數(shù)量；

配套資料整理：整理全套實驗報告，包含實驗流程、所有質控數(shù)據(jù)、鑒定結果、細胞培養(yǎng)手冊（含培養(yǎng)基配方、傳代方法、凍存/復蘇步驟、篩選藥物維持濃度）；

無菌/支原體復檢：對最終交付的細胞進行無菌培養(yǎng)檢測和支原體檢測，確保無細菌、真菌、支原體污染。

七、最終交付清單（標準化）

合格的穩(wěn)轉細胞株凍存管（多克隆/單克隆，按需求）；

穩(wěn)轉細胞株構建全套實驗報告（含所有原始數(shù)據(jù)、質控結果）；

剩余的重組質粒/慢病毒液（按需，凍存管）；

細胞培養(yǎng)操作手冊（含詳細的培養(yǎng)、傳代、凍存復蘇方法）；

無菌/支原體檢測報告、藥物篩選濃度摸索報告；

售后技術支持卡（含后續(xù)細胞培養(yǎng)問題解答、株系復壯指導）。

八、售后技術支持（無期限，標準化服務）

商業(yè)服務均包含全程售后，解決客戶后續(xù)使用中的問題，核心內(nèi)容：

細胞復蘇、培養(yǎng)、傳代的技術指導，若客戶復蘇后細胞狀態(tài)不佳，可提供復壯建議；

穩(wěn)轉株若出現(xiàn)表達量下降，協(xié)助分析原因并提供解決方案；

提供實驗后續(xù)的技術咨詢（如基于穩(wěn)轉株的功能實驗設計、檢測方法建議）；

若出現(xiàn)菌株污染/無表達等符合售后標準的問題，服務方免費重新構建（依服務合同約定）。

九、不同構建類型的周期參考（標準化，不含前期溝通）

構建類型	多克隆穩(wěn)轉株	單克隆穩(wěn)轉株	備注
常規(guī)目的基因過表達	15-20個工作日	20-25個工作日	含密碼子優(yōu)化、載體構建
shRNA 基因敲低	18-22個工作日	22-28個工作日	含3-5條 shRNA 序列篩選
CRISPR/Cas9基因敲除	20-25個工作日	25-30個工作日	含gRNA篩選、敲除效率驗證
誘導型表達穩(wěn)轉株	25-30個工作日	30-35個工作日	含Tet系統(tǒng)載體構建、誘導驗證
定點敲入/融合表達	30-35個工作日	35-40個工作日	難度較高，需同源重組驗證