流式抗體染色的操作流程
日期：2026-03-19 09:19:46
流式細胞術（Flow Cytometry，FC）的抗體染色是獲取高質量數據的關鍵步驟。根據樣本類型（懸浮細胞或貼壁細胞）以及檢測目標（表面抗原或胞內抗原），操作細節會有所不同。以下是通用的流式抗體染色標準操作流程步驟。
一、實驗前準備
1、試劑準備：
準備好預冷的流式染色緩沖液（FACS Buffer，通常為含1%-2% BSA或FBS的PBS）。
準備好所需的熒光標記抗體，查閱說明書確認最佳使用量。
若需進行胞內染色，需準備細胞固定/破膜試劑盒。
準備紅細胞裂解液（若樣本為全血或含大量紅細胞）。
2、儀器與耗材：
流式管（通常為5mL圓底管）、移液器及槍頭。
細胞計數儀或血球計數板。
離心機（需具備4℃制冷功能）。
3、對照設置：
務必設置未染色對照（用于調節電壓和設門）。
設置單染對照（用于補償調節，特別是多色實驗）。
設置同型對照（可選，用于評估非特異性結合，但在現代多色流式中，FMO對照更為重要）。
二、樣本制備與單細胞懸液獲取
情況A：懸浮細胞（如淋巴細胞、培養的血細胞系）
收集細胞至離心管中。
用預冷的FACS Buffer重懸細胞，離心（通常300-400g，5分鐘，4℃）。
棄上清，輕彈管底使細胞沉淀松散。
情況B：貼壁細胞
吸除培養基，用PBS洗滌一次。
使用不含EDTA的胰酶消化細胞（注意：部分表面抗原對胰酶敏感，需改用細胞刮刀或無酶消化液）。
加入含血清的培養基終止消化，吹打制成單細胞懸液。
轉移至離心管，離心（300-400g，5分鐘，4℃），棄上清。
情況C：全血樣本
直接取適量全血（通常100μL）加入流式管。
先進行表面抗體染色（見下文步驟），染色完成后加入紅細胞裂解液處理，避光孵育10-15分鐘。
離心，棄上清，用FACS Buffer洗滌一次。
三、表面抗原染色流程（Surface Staining）
這是最基礎的染色步驟，適用于檢測細胞膜表面的蛋白。
1、封閉（可選但推薦）：
若細胞表達Fc受體（如單核細胞、巨噬細胞），建議先用抗人/抗鼠Fc受體阻斷劑或正常血清在冰上孵育10-15分鐘，以減少非特異性結合。若不封閉，可跳過此步直接進入下一步。
2、抗體孵育：
將細胞沉淀重懸于適量的FACS Buffer中（通常每管50-100μL）。
加入預先滴定好濃度的熒光標記抗體。
關鍵操作：輕輕吹打混勻，避免產生氣泡。
置于4℃避光孵育20-30分鐘。（注：4℃可減少細胞內吞作用，保持表面抗原穩定；避光是為了防止熒光淬滅）。
3、洗滌：
加入2-3mL預冷的FACS Buffer。
離心（300-400g，5分鐘，4℃）。
小心棄去上清，注意不要吸走細胞沉淀。
重復洗滌一次（共洗滌2次），以去除未結合的游離抗體，降低背景噪音。
4、重懸：
加入300-500μL FACS Buffer重懸細胞。
此時樣本即可上機檢測。若不能立即上機，可暫存于4℃避光處，但建議在4小時內完成檢測。
四、胞內抗原染色流程（Intracellular Staining）
若目標蛋白位于細胞內部（如細胞因子、轉錄因子），必須在表面染色后進行固定和破膜。
1、完成表面染色：
先按照上述“表面抗原染色流程”完成表面抗體的孵育和洗滌。注意：此階段使用的抗體必須是耐受后續固定破膜試劑的（查閱抗體說明書）。
2、固定（Fixation）：
棄去上清，加入固定液（通常為含多聚甲醛的溶液）。
室溫避光孵育15-20分鐘（具體時間依試劑盒說明而定）。
加入滲透/洗滌緩沖液（Perm/Wash Buffer），離心棄上清。
3、破膜與胞內抗體孵育（Permeabilization & Staining）：
用破膜緩沖液（Perm Buffer）重懸細胞沉淀。
加入針對胞內抗原的熒光抗體。
室溫避光孵育30-45分鐘（胞內抗體通常在室溫下結合效率更高，具體視抗體而定）。
4、洗滌：
加入過量的破膜緩沖液洗滌細胞，離心棄上清。
重復洗滌1-2次，徹底去除未結合的胞內抗體。
5、重懸：
最后用FACS Buffer或破膜緩沖液重懸細胞，上機檢測。
五、上機檢測與數據分析
1、過濾：
在上機前，建議使用35μm或40μm的細胞濾網過濾樣本，防止細胞團塊堵塞流式細胞儀的噴嘴。
2、上機采集：
先運行未染色對照，調節各通道的電壓（PMT），確保陰性群落在低熒光區域。
運行單染對照，計算并設置熒光補償（Compensation），消除光譜重疊。
采集實驗樣本，記錄足夠數量的事件數（通常每個樣本至少采集10,000個目標細胞）。
3、數據清洗：
實驗結束后，立即用專用的流式管路清洗液（如10%漂白劑水溶液，隨后用大量清水）沖洗儀器，防止熒光染料殘留污染管路。
六、關鍵注意事項
避光原則：從加入熒光抗體開始，直到上機檢測結束，所有步驟均應盡量避光操作，以防熒光信號衰減。
溫度控制：表面染色務必在4℃進行，以防止抗原內陷或細胞狀態改變；胞內染色固定后的步驟通常可在室溫進行，但需嚴格遵循試劑盒說明書。
細胞活力：死細胞會非特異性地吸附大量抗體，造成假陽性。建議在染色前使用死活染料（Viability Dye）排除死細胞，或在分析時通過散射光（FSC/SSC）和死活染料門控剔除死細胞。
抗體滴定：不要盲目使用說明書推薦的最高濃度。不同實驗室條件和細胞類型可能需要不同的最佳抗體濃度，預先進行抗體滴定實驗能獲得最佳的信噪比。
輕柔操作：在重懸細胞時動作要輕柔，避免劇烈吹打造成的機械損傷或產生過多氣泡。
